植物组织培养方法1MS培养基的配制包括以下步骤.
培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分,为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量,可将培养基中的各种成分,按原量的20倍或200倍分别称量,配成浓缩液,这种浓缩液叫做培养基母液.这样每次使用时,取其总量的1/20(50mL)或1/200(5mL),加水稀释,制成培养液.现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出,供配制时使用.
大量元素(母液Ⅰ)mg/L
NH4NO333000
KNO338000
CaCl2·2H2O8800
MgSO4·7H2O7400
KH2PO43400
微量元素(母液Ⅱ)
KI166
H3BO31240
MnSO4·4H2O4460
ZnSO4·7H2O1720
Na2MoO4·2H2O50
CuSO4·5H2O5
CoCl2·6H2O5
铁盐(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O5560
Na2-EDTA·2H2O7460
有机成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇20000
ⅣB
烟酸100
盐酸吡哆醇(维生素B6)100
盐酸硫胺素(维生素B1)100
甘氨酸400
以上各种营养成分的用量,除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外,其余的均为200倍浓缩液.
上述几种母液都要单独配成1L的贮备液.其中,母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是:每种母液中的几种成分称量完毕后,分别用少量的蒸馏水彻底溶解,然后再将它们混溶,最后定容到1L.
母液Ⅲ的配制方法是:将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中,边加热边不断搅拌使它们溶解,然后将两种溶液混合,并将pH调至5.5,最后定容到1L,保存在棕色玻璃瓶中.
各种母液配完后,分别用玻璃瓶贮存,并且贴上标签,注明母液号、配制倍数、日期等,保存在冰箱的冷藏室中.
MS培养基中还需要加入2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质,并且分别配成母液(0.1mg/mL).其配制方法是:分别称取这3种物质各10mg,将2,4-D和NAA用少量(1mL)无水乙醇预溶,将6BA用少量(1mL)的物质的量浓度为0.1mol/L的NaOH溶液溶解,溶解过程需要水浴加热,最后分别定容至100mL,即得质量浓度为0.1mg/mL的母液.
配制培养液用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量:母液Ⅰ为50mL,母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5mL.再取2,4-D5mL、NAA1mL,与各种母液一起放入烧杯中.
配制培养液时应注意:①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前,轻轻摇动盛放母液的瓶子,如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染,应立即淘汰这种母液,重新进行配制;②用量筒或移液管量取培养基母液之前,必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次;③量取母液时,最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上,量取1种,划掉1种,以免出错.
溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9g、蒸糖30g,放入1000mL的搪瓷量杯中,再加入蒸馏水750mL,用电炉加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状.然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中,最后加蒸馏水定容至1000mL,搅拌均匀.
调pH用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸(5.7.0)测培养基的pH,一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8).
2BA为细胞分裂素NAA是萘乙酸,为生长素的一种
3适于百合根的激素暂时没找到
以下是叶片和胚的激素:对麝香百合(LiliumlongiflorumThunb)叶片进行离体培养,可成功获得无菌苗.试验结果表明:培养基MS+BA01mg/L+NAA10mg/L适于初代培养,有助于根和芽的分化;MS+BA05mg/L+NAA15mg/L适于增殖培养,利于愈伤组织的产生,并促进芽的分化;生根培养基为1/2MS+NAA10mg/L+多效唑100mg/L;当试管苗根长1cm时移栽易成活
在含有1mg/LIAA,1mg/LGA3,600mg/LCH的MS培养基上培养,蔗糖含量为68%时,百合幼胚胚性生长最好,培养30d后可以得到正常胚.在含有0.1mg/LNAA,1mg/LBA的MS培养基上可以形成淡绿色的愈伤组织,将这些愈伤组织转移到1/2MS无激素的培养基上培养可以形成大量的不定芽,不定芽生根移栽后,其成活率可达90%以上